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SMN1基因外显子缺失检测试剂产物审评近况

作者:中国医药报  欣赏次数:  日期:2018-10-24  
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脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传病,居儿童致去世性常染色体隐性遗传病的第2位。位于染色体5q11.2~q13.3上的活动神经元存活基因(Survivalmotorneuron,SMN)是SMA的重要致病基因。

  人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因:端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2,两者仅有5个碱基差别。SMN1是重要功效基因,该基因渐变可招致SMA发病,SMN2为临床表型的调治基因,影响病情的严峻水平,其拷贝数增长可加重SMA表型。现在已知约94%的SMA患者为SMN1基因第7和(或)第8外显子纯合缺失所致,多数病例可由SMN1基因点渐变或小的缺失惹起。

  SMN1基因外显子缺失检测的意义

  SMA在人群中的发病率为1/5000~1/10000,群体携带者频率为1/35~1/50,是出生缺陷的高危要素,因而极有须要举行SMA携带者的人群筛查,并经过产前诊断技能低落人群中SMA患儿的出生率。

  临床大将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,即婴儿型、中心型和少年型,严峻水平顺次递加。神经专科大夫一样平常凭据患者发病年事、临床体现及病情希望水平举行临床诊断,帮助查抄要领包罗肌电图、肌酶和肌肉活检,联合家属史和SMN1基因剖析可举行确诊。由于SMA患儿中约94%为SMN1基因外显子纯合缺失,因而,SMN1基因缺失检测对付SMA的诊断具有更高的敏捷度和特异性。且对差别型的SMA患者,SMN1纯合缺失率没有明显差别,以是,SMN1纯合缺失的检测对付差别型SMA患者具有雷同的临床诊断代价。在泰西人群中,SMN1基因纯合缺失检测已成为诊断和清除诊断SMA的首选要领。

  SMN1基因缺失检测试剂的近况

  现在,SMN1基因外显子缺失检测试剂较为缺乏,临床查验实行室较为公认的要领是PCR联合限定性片断长度多态性(PCR-RFLP)的要领。但该要领操纵较为繁琐,且反复性差,倒霉于尺度化,不易推行。同时,这种要领只能检测出纯合缺失,无法确认杂合缺失。

  荷兰的SMAMLPA检测试剂可看待测靶序列举行半定量剖析,因而既可检测纯合缺失,亦可确认杂合缺失。在海内外已有多篇文献报道接纳该要领举行SMA患者诊断和SMA携带者筛查。但该产物现在仍为“仅用于研讨”的试剂,尚未根据体外诊断类医疗东西上市(98/79/EC)。

  2015年末,原国度食品药品羁系总局答应了第一项SMN1缺失渐变检测试剂上市。该产物接纳多重及时荧光MGB-TaqMan探针PCR法,以人基因组单拷贝基因RPP40为内参基因,对SMN1基因第7外显子和第8外显子拷贝数举行绝对定量检测,用于SMA患者的体外帮助分子诊断。SMN1基因外显子缺失检测的难点之一在于清除高同源性基因SMN2的滋扰,特殊是对付SMN2高拷贝数的受试者,需包管结果的正确牢靠。该产物经过对及时荧光PCR绝对定量、相对定量技能举行体系整合,并在反响体系中参加特定化学组分,以克制PCR引物3’真个胞嘧啶(C)与胸腺嘧啶(T)的错配,增长PCR扩增的特异性,从而有用控制SMN2基因非特异性扩增对检测结果的影响,正确检出高拷贝数SMN2样本中SMN1基因第7和第8外显子的缺失环境。

  鉴于海内外尚无任何根据体外诊断试剂答应上市的SMA分子诊断产物,因而临床实验方案中根据EMQN关于《SMA分子诊断最佳理论指南》,接纳了海内外SMA体外帮助分子诊断范畴公认的PCR-RFLP法作为比较要领。临床实验共完成1069例,此中正常比较组777例,SMA病例组292例,统计剖析结果表现报告产物与比拟要领检测结果的同等性为100%(95%相信区间:99.66%~100%)。别的,9747例正常成年人大样本中目的外显子△△Ct漫衍范畴的观察亦表现,该产物的纯合渐变果断界值设置公道。

  该试剂现在答应的预期用处仅包罗纯合缺失的检测,尚不克不及用于杂合缺失的检测,因而无法用于SMA携带者的筛查,这是该产物的缺陷之一。

  究竟上,该产物在设计上已思量到SMA携带者的检测,其检测原理因此待测样本中目的外显子荧光信号Ct值与内参基因荧光信号Ct值之差(△Ct_s),与正常比较品三个梯度浓缩品中目的外显子荧光信号Ct值和内参基因荧光信号Ct值之差的均匀值(△Ct_a)之差,即△△Ct,作为待测样本中目的外显子拷贝数检测变量(△△Ct=△Ct_s-△Ct_a)。凭据及时荧光定量PCR绝对定量的基本数学原理推导失掉报告产物检测变量△△Ct的盘算公式,根据这一盘算公式可推导出纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct实际值(或范畴);再联合目的外显子与内参基因扩增服从差别以及SMN2差别拷贝数的影响,可对上述△△Ct实际值举行优化。结果表现纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct值(或范畴)之间可设置公道的果断界值,因而实际上该产物可辨别检测出三种基因形态。但鉴于消费企业对杂合缺失与野生型之间的果断界值研讨尚不透彻,再加上缺乏可判断杂合缺失的比拟要领等其他困难,本次注册请求的预期用处仅限于检测纯合渐变,即SMA患者帮助诊断。

  综上,SMN1基因外显子缺失检测在SMA疾病诊断和SMA携带者筛查中具有紧张的临床代价。但是到现在为止,遭到技能程度的限定,相干的体外诊断试剂比力缺乏,特殊是可用于SMA携带者筛查的杂合缺失检测,尚无得当的体外诊断试剂上市。(器审中央审评六部  何静云)


泉源:中国医药报